PCR小小疑问...

豪杰汉子

PCR基本步骤分为denaturation, annealing和extension,个别的温度大概是94C,5xC和74C.我想请问一下，由于primer的melting temperature是annealing temperature+2（也就是五十多度而已),在经过extension步骤后，PCR要怎样进行第二次的cycle呢？那些free primer不是都已经在extension的温度下(74C)melt了吗？

谢谢解答

@res

increase temp，DNA unwind and 变成templete，DNA primer bind, DNA synthesis occur。然后cool down，DNA wind again.2nd round, 一样,increase temp, then bla bl bla....一直repeat;p

eve_angel

primer 不会 melt，even at high temperature. 他会denature and will not bind to your template。
下一个cycle 的annealing 时，会再anneal 到template。

豪杰汉子

谢谢两位大大的解答 我明白了

豪杰汉子

大家好...这是我目前在industrial training 第一次做的pcr product,好高兴哦
（1kb DNA ladder, 我的是well 3)



[ 本帖最后由 豪杰汉子 于 23-5-2008 10:34 AM 编辑 ]

eve_angel

你在那里做LI? PCR 什么？
Band 很亮一下。。。不错哦！！！

另外3个well 呢？

豪杰汉子

原帖由 eve_angel 于 23-5-2008 11:36 AM 发表
你在那里做LI? PCR 什么？
Band 很亮一下。。。不错哦！！！

另外3个well 呢？

谢谢~
usm.
与我的final year project supervisor做的。
哦...这是klebsiella的一个ORF来的.
另外3个well是我的朋友的product来的。我们clone不同的ORF

无药可救的脑残

楼主在哪念啥科系？

eve_angel

原帖由 豪杰汉子 于 23-5-2008 11:27 PM 发表

谢谢~
usm.
与我的final year project supervisor做的。
哦...这是klebsiella的一个ORF来的.
另外3个well是我的朋友的product来的。我们clone不同的ORF

第一次就酱美。不错哦。。。
你自己optimise的还是照人家optimize 的来做的？
PCR 后要拿来干嘛？
cloning 而已， 还是要做 expression？

豪杰汉子

原帖由 无药可救的脑残 于 24-5-2008 04:27 AM 发表
楼主在哪念啥科系？

吉兰丹理大 生物医学系(Biomedicine)

原帖由 eve_angel 于 24-5-2008 12:28 PM 发表


第一次就酱美。不错哦。。。
你自己optimise的还是照人家optimize 的来做的？
PCR 后要拿来干嘛？
cloning 而已， 还是要做 expression？

呃...算是照别人optimize的来做吧？我在网上查找mixture的资料，然后再和senior的protocol对比过。才第一次做，不懂什么才是optimize 或许将来我面对问题了就会从经验学到了吧
有做expression，但不是我做了。这个只是L.I的小题目而已。
迟点我要开始我自己的fyp咯。